|
ПРИКАЗ МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
22 декабря 2004 г. № 286
О МЕРАХ ПО СОВЕРШЕНСТВОВАНИЮ ПРОФИЛАКТИКИ
И ДИАГНОСТИКИ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
В 2004 году в Республике Беларусь на фоне многолетней
тенденции к снижению наблюдается рост заболеваемости менингококковой
инфекцией. За 11 месяцев 2004 года показатель заболеваемости этой
инфекцией вырос на 15% и составил 2,91 на 100 тысяч населения (в
2003 году - 2,53 на 100 тысяч населения).
Высокий уровень летальности (10,1%) от менингококковой
инфекции свидетельствует о снижении настороженности медицинских
работников к данному заболеванию.
Существующие проблемы лабораторной диагностики по
этиологической расшифровке гнойных бактериальных менингитов не
позволяют отслеживать формирование эпидемических штаммов
менингококков (серогруппы A и C), а также исключить гипердиагностику
менингококковой инфекции.
В целях обеспечения эпидемиологического благополучия по
менингококковой инфекции на территории Республики Беларусь
ПРИКАЗЫВАЮ:
1. Утвердить:
1.1. инструкцию "О проведении эпидемиологического надзора за
менингококковой инфекцией" согласно приложению 1;
1.2. инструкцию "Противоэпидемические мероприятия при
менингококковой инфекции" согласно приложению 2;
1.3. инструкцию "Микробиологическая диагностика
менингококковой инфекции" согласно приложению 3;
1.4. инструкцию "Использование реакции непрямой
гемагглютинации для выявления антител при менингококковой инфекции"
согласно приложению 4.
2. Начальникам управления здравоохранением (охраны здоровья)
облисполкомов и председателю комитета по здравоохранению Минского
горисполкома, главным государственным санитарным врачам
административных территорий организовать работу по осуществлению
эпидемиологического надзора и совершенствованию диагностических и
профилактических мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией в
соответствии с приложениями к данному приказу.
3. Не применять на территории Республики Беларусь приказ
Министерства здравоохранения СССР от 01.12.88 г. № 858 "О мерах по
совершенствованию лечебно-диагностических и профилактических
мероприятий по борьбе с менингококковой инфекцией и внедрению
эпидемиологического надзора".
4. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на
Первого заместителя Министра Колбанова В.В. и заместителя Министра -
Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь
Римжу М.И.
Министр Л.А.Постоялко
Приложение 1
к приказу
Министерства
здравоохранения
Республики Беларусь
22.12.2004 № 286
ИНСТРУКЦИЯ
"О проведении эпидемиологического надзора
за менингококковой инфекцией"
Эпидемиологический надзор за менингококковой инфекцией -
комплексное динамическое наблюдение за эпидемическим процессом,
включающее многолетний и внутригодовой анализ заболеваемости и
летальности в разных возрастных группах и контингентах населения,
клинических проявлений инфекции и факторов, способствующих ее
распространению (носительство менингококка, иммунологическая
структура, биологические особенности возбудителя, социальные и
природные факторы и др.).
Цель эпидемиологического надзора: оценка эпидемиологической
ситуации на конкретный момент времени, составление краткосрочного
прогноза и рекомендаций для проведения наиболее рациональных мер
борьбы с инфекцией с целью снижения заболеваемости и летальности.
Эпидемиологический надзор должен осуществляться комплексно при
участии эпидемиологов, клиницистов, микробиологов, организаторов
здравоохранения.
Система эпидемиологического надзора включает:
1. Слежение за заболеваемостью и летальностью менингококковой
инфекции и гнойных менингитов другой этиологии.
2. Слежение за массивностью циркуляции менингококков среди
населения и их свойствами.
3. Иммуноэпидемиологические исследования с целью выявления
групп наибольшего риска заболевания.
4. Эпидемиологический анализ ситуации и оценка эффективности
проводимых мероприятий.
Глава 1
СЛЕЖЕНИЕ ЗА ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ И ЛЕТАЛЬНОСТЬЮ МЕНИНГОКОККОВОЙ
ИНФЕКЦИИ И ГНОЙНЫХ МЕНИНГИТОВ ДРУГОЙ ЭТИОЛОГИИ
Характеристика эпидемиологической ситуации на конкретной
территории складывается из анализа уровня заболеваемости в целом, а
также по отдельным возрастным группам и контингентам населения.
Анализ проводится раздельно для генерализованных и локализованных
форм менингококковой инфекции. Основным источником сведений о
заболевших является экстренное извещение (Ф. 058-у), а также
результаты лабораторных исследований. Этиология заболевания
определяется выделением возбудителей из ликвора, крови и
носоглоточной слизи больных, их антигенов в ВИЭФ, ИФА, других
реакциях, а также по динамике титров антител в РПГА к основным
серогруппам менингококков.
Глава 2
СЛЕЖЕНИЕ ЗА ЦИРКУЛЯЦИЕЙ МЕНИНГОКОККОВ
В НАСЕЛЕНИИ И ИХ СВОЙСТВАМИ
Характеристика циркулирующих штаммов менингококков на
территории складывается из анализа следующих показателей:
1. Серогрупповая принадлежность менингококков, выделенных от
больных генерализованными формами инфекции и менингококковыми
назофарингитами;
2. Серогрупповая принадлежность менингококков, выделенных от
носителей в очагах инфекции;
3. Серогрупповая характеристика менингококков, выделенных от
носителей в "индикаторных" группах, которыми являются:
- дети 6 - 8 лет, посещающие подготовительные группы детских
дошкольных учреждений и 0 - 1 классы школ;
- подростки и взрослые, объединенные проживанием в общежитиях;
- учащиеся средних и высших учебных заведений, 9 - 11 классов
общеобразовательных школ.
Бактериологическое обследование на носительство менингококков
в "индикаторных" группах рекомендуется проводить в первую очередь в
коллективах, где имеют место случаи групповых заболеваний острыми
респираторными инфекциями (в течение 7 дней возникает 3 и более
случаев заболевания). Обследование проводится в зимне-весенний
период (декабрь - май) и должно охватывать от 500 до 1000 человек.
4. Определение чувствительности к сульфаниламидам и
антибиотикам штаммов менингококков, выделенных из ликвора и крови
больных, и из носоглоточной слизи носителей и больных
назофарингитами.
Глава 3
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА
ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ НАСЕЛЕНИЯ
Иммунологические исследования менингококков ведутся
бактериологическими лабораториями областных центров гигиены,
эпидемиологии и общественного здоровья и Минского городского центра
гигиены и эпидемиологии с помощью РПГА с менингококковыми
полисахаридными диагностикумами.
Серологические исследования проводятся среди детей возрастной
группы 6 - 8 лет, посещающих подготовительные группы детских
дошкольных учреждений, школьников первых классов общеобразовательных
школ (2% от общей их численности). Исследуются также сыворотки
взрослых (декретированные контингенты, беременные и роженицы).
По мере необходимости исследованию должно подвергаться не
менее 1000 человек в 1, 2 и 4 кварталах года.
Глава 4
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
Эпидемиологической оценке подлежат следующие показатели:
1. территориальное распределение заболевших генерализованными
формами менингококковой инфекции (ГФМИ);
2. помесячное распределение заболевших ГФМИ в разрезе района,
города, области, республики по каждому возрасту в абсолютных и
относительных показателях;
3. распределение заболевших ГФМИ по клиническим формам
болезни;
4. распределение заболевших по контингентам;
5. очаговость генерализованных форм инфекции в коллективах;
6. летальность инфекции в разных возрастных группах;
7. сроки госпитализации больных;
8. серогрупповая принадлежность менингококков, выделенных от
больных;
9. распределение носителей менингококков по возрастам;
10. серологический пейзаж менингококков, выделенных от
носителей в очагах инфекции и в "индикаторных" группах.
Для полноценного эпидемиологического анализа дается оценка
эпидемиологической ситуации в отношении менингококковой инфекции на
конкретной территории. Для ее краткосрочного прогнозирования (на 2 -
3 года) могут быть использованы следующие признаки.
Для начала эпидемического подъема характерно:
- общий рост заболеваемости по сравнению с предыдущими годами;
- преимущественное выделение из крови и ликвора больных одной
(ведущей) серогруппы менингококка (A, B, C и др.);
- рост заболеваемости лиц старшего возраста (подростков и
взрослых);
- появление очагов с множественными заболеваниями
генерализованными формами инфекции в организованных коллективах с
круглосуточным пребыванием детей и подростков;
- увеличение уровня носительства одной из ведущих серогрупп
менингококка;
- увеличение удельного веса лиц с титрами
противоменингококковых антител выше 1:40 по сравнению с предыдущими
2 - 3 годами (как отражение активизации циркуляции менингококка).
Признаки завершения эпидемического подъема заболеваемости:
- постепенное снижение заболеваемости, в первую очередь, у
взрослых, подростков, затем детей старших возрастных групп;
- возрастание удельного веса среди заболевших детей до 5 лет,
особенно значительное у возрастной группы до 2 лет;
- уменьшение этиологической роли менингококка, вызвавшего
эпидемический подъем и увеличение возбудителей других серогрупп, в
том числе редко встречающихся;
- отсутствие очагов с множественными заболеваниями ГФМИ;
- снижение в очагах инфекции циркуляции менингококка,
вызвавшего подъем заболеваемости;
- высокий уровень противоменингококковых антител (при низком
количестве отрицательных проб) к серогруппе менингококка, вызвавшего
подъем заболеваемости.
Глава 5
РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА
ЗА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
В результате анализа эпидемиологической ситуации и прогноза ее
дальнейшего развития органами здравоохранения планируется комплекс
диагностических, лечебных, профилактических и противоэпидемических
мероприятий и доводится до сведения руководителей лечебно-
профилактических и санитарно-эпидемиологических организаций
(обратная связь). Оценка своевременности и полноты проводимых
мероприятий проводится в течение года, обязательно в 1 квартале за
отчетный год.
Приложение 2
к приказу
Министерства
здравоохранения
Республики Беларусь
22.12.2004 № 286
ИНСТРУКЦИЯ
"Противоэпидемические мероприятия при менингококковой инфекции"
Источником менингококковой инфекции является больной человек
или бактерионоситель; заражение происходит воздушно-капельным путем.
Различают 3 группы источников инфекции:
1. Больные генерализованными формами менингококковой инфекции
- ГФМИ (около 1% от общего числа инфицированных лиц).
2. Больные менингококковым назофарингитом (10 - 20% от общего
числа инфицированных лиц).
3. "Здоровые" носители - лица, выделяющие менингококки и не
имеющие воспалительных изменений в носоглотке.
Наиболее опасным источником инфекции в домашнем очаге является
больной генерализованной формой - ГФМИ (менингитом,
менингококцемией, менингоэнцефалитом и др.) в остром периоде
болезни.
Определенное эпидемиологическое значение в организованных
коллективах принадлежит больным менингококковым назофарингитом, так
как эти больные обычно не изолируются из коллектива.
"Здоровый" носитель имеет значительно меньшую заражающую
способность. Вместе с тем, число носителей в сотни раз превышает
число больных: эпидемический процесс при менингококковой инфекции
поддерживается последовательным состоянием носительства.
Длительность носительства менингококков составляет в среднем 2 - 3
недели, у 2 - 3% лиц носительство может продолжаться в течение 6 и
более недель. Есть отдельные сведения о более длительном
носительстве, особенно при наличии хронического воспалительного
состояния носоглотки.
Очаг менингококковой инфекции характеризуется появлением в
семье, детском учреждении, школе и других коллективах больного ГМФИ.
Границы очага определяются при эпидемиологическом обследовании в
каждом конкретном случае, выявляются все общавшиеся с заболевшим
лица для более полной диагностики больных менингококковым
назофарингитом и носителей. Очаговость заболеваний ГФМИ не резко
выражена и встречается редко.
Очаги подразделены на две категории: с небольшим числом
общающихся между собой лиц и четко очерченными границами (семейные
очаги, очаги в группах детских коллективов, классах школ) или очаги,
где определение границ затруднено в связи со значительным числом
лиц, находящихся в тесном общении (учащиеся, военнослужащие,
работники предприятий и учреждений и пр.).
Переуплотнение, повышенная влажность воздуха в помещении,
нарушение санитарно-гигиенического режима способствуют
распространению инфекции и возникновению групповых заболеваний
менингококковой инфекцией. Вспышки происходят чаще в организованных
коллективах детей и подростков, как правило, в течение первых недель
после их формирования или в период сезонного подъема заболеваемости.
При этом наибольшему риску заражения подвергаются лица, вновь
поступившие в коллективы, особенно прибывшие из других населенных
пунктов.
Глава 1
ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ
В ОЧАГЕ МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
Обязательной регистрации и подаче экстренного извещения ф.
058/у в территориальные центры гигиены и эпидемиологии подлежат
случаи генерализованной формы менингококковой инфекции (ГФМИ):
менингококковый менингит, менингококцемия (сепсис без поражения
мозговых оболочек) и их сочетанные формы, а также на все случаи
бактерионосительства менингококковой инфекции, выявленной в очаге
гнойных менингитов и менингококковой инфекции. При наличии групповых
заболеваний подается внеочередное донесение в Министерство
здравоохранения Республики Беларусь в установленном порядке.
Больные генерализованной формой менингококковой инфекции или
при подозрении на нее, немедленно госпитализируются в
специализированные отделения инфекционных больниц, а при их
отсутствии - в боксы или полубоксы.
Больные с бактериологически подтвержденным менингококковым
назофарингитом, выявленные в очагах инфекции, в зависимости от
тяжести клинического течения, помещаются в инфекционные больницы.
Они могут быть изолированы на дому, если в семье или квартире нет
детей дошкольного возраста и лиц, работающих в детских дошкольных
учреждениях, а также при условии проведения регулярного медицинского
наблюдения и лечения.
Контактные с больным, оставленным на дому, дети, посещающие
детские дошкольные учреждения, и лица, работающие в этих
учреждениях, допускаются в коллектив только после медицинского
осмотра и однократного бактериологического обследования с
отрицательным результатом.
Выписка из стационара больных ГФМИ и назофарингитом проводится
после полного клинического выздоровления, без бактериологического
обследования на носительство менингококков.
Реконвалесценты менингококковой инфекции допускаются в детские
дошкольные и оздоровительные учреждения, школы, школы-интернаты,
санатории и учебные заведения, стационары после одного
отрицательного результата бактериологического обследования,
проведенного не ранее, чем через 5 дней после выписки из стационара
или выздоровления больного назофарингитом на дому.
Различные профилактические прививки реконвалесцентам,
перенесшим генерализованную форму менингококковой инфекции, проводят
в соответствии с приказом МЗ РБ № 275 от 01.09.1999 года "О
дальнейшем совершенствовании календаря профилактических прививок и
основных положениях об их организации и проведении".
После госпитализации больного ГФМИ осуществляют следующие
мероприятия:
- определяют границы очага, выявляются лица, контактные с
больным с учетом продолжительности и близости общения;
- в детских дошкольных учреждениях, домах ребенка, школах-
интернатах, детских санаториях, школах (классах) устанавливается
карантин сроком на 10 дней с момента изоляции последнего больного. В
течение этого срока запрещается прием новых и временно отсутствующих
детей, а также переводы детей и персонала из одной группы (класса) в
другую;
- все лица, общавшиеся с больным в коллективе, семье
(квартире), подвергаются медицинскому осмотру (в коллективах
обязательно с участием отоларинголога). Особое внимание уделяется
выявлению лиц с хроническими воспалительными явлениями в носоглотке
и лиц, имеющих неясные "аллергические" высыпания на коже. При
наличии патологических изменений в носоглотке больные изолируются из
коллектива, а контактные в семье (квартире) не допускаются в детские
коллективы и школы до установления диагноза. Лица с подозрительными
высыпаниями на коже госпитализируются для исключения
менингококцемии;
- в очаге проводится клиническое наблюдение с осмотром
носоглотки, кожных покровов и ежедневной термометрией в течение 10
дней (срок карантина);
- детям в возрасте с 6 месяцев до 3 лет, общавшимся с больными
генерализованной формой менингококковой инфекции, с профилактической
целью вводят нормальный иммуноглобулин в дозе 1,5 мл, а в возрасте
от 3 до 7 лет включительно - 3,0 мл. Препарат вводят внутримышечно,
однократно, не позднее седьмого дня после контакта с больным ГФМИ.
Проводится бактериологическое обследование:
а) в детских учреждениях - детей, бывших в общении с больными,
и обслуживающего персонала всего учреждения;
б) в школах - учащихся и преподавателей класса, где
зарегистрирован больной;
в) в школах-интернатах (круглосуточное пребывание детей) -
учащихся, общавшихся с больным в классе и в спальной комнате, а
также преподавателей и воспитателей данного класса;
г) в семьях, квартирах - все лица, общавшиеся с больными;
д) в учреждениях, обеспечивающих профессионально-техническое,
специальное и высшее образование, при возникновении случая
заболевания на первом курсе - преподавателей и студентов всего
курса; на старших курсах - только общавшихся с больным в учебной
группе и комнате общежития;
е) в других организованных коллективах - лиц, проживающих в
общежитии (круг контактных лиц определяет врач эпидемиолог).
В детских дошкольных учреждениях бактериологические
обследования контактных проводятся не менее двух раз с интервалом в
3 - 7 дней, в остальных коллективах - однократно.
Носители менингококков, выявленные при бактериологическом
обследовании в детских дошкольных коллективах, школах-интернатах и
других детских учреждениях, выводятся из коллектива на срок
проведения санации. Из коллектива взрослых, в том числе учебных
заведений, носители не изолируются.
Носители менингококков - дети и взрослые, выявленные в
семейных очагах, в детские дошкольные учреждения, школы, школы-
интернаты, санатории, пионерские лагеря и др. детские учреждения не
допускаются, бактериологическое обследование коллективов, которые
посещали эти носители, не проводится.
При выявлении носителя менингококков среди больных
соматических стационаров его следует изолировать в бокс или
полубокс. Вопрос о санации решается в зависимости от основного
заболевания. При отсутствии возможности изоляции носителя курс
санации проводится обязательно. Персонал отделения подвергается
однократному бактериологическому обследованию, выявленные носители
отстраняются от работы на время проведения санации.
Больные острым назофарингитом (бактериологически не
подтвержденным), выявленные в очаге менингококковой инфекции,
подлежат лечению по назначению врача, установившего диагноз. Из
детских дошкольных коллективов эти больные изолируются на время
лечения и допускаются в коллектив только после исчезновения острых
явлений.
Выявленные носители менингококков санируются антибиотиками на
дому или в специально развернутых для этих целей отделениях. По
назначению врача взрослым рекомендуется применять ципрофлоксацин 500
мг однократно или рифампицин по 600 мг ежедневно в течение 2 дней.
Для детей применяется рифампицин в дозировке в соответствии с
возрастом.
Через 3 дня после окончания курса санации носители, независимо
от примененного препарата, подвергаются однократному
бактериологическому обследованию и при наличии отрицательного
бактериологического анализа они допускаются в коллективы.
При длительном носительстве (свыше 1 месяца) и отсутствии
воспалительных изменений в носоглотке носитель допускается в
коллектив, где он был выявлен.
Заключительная дезинфекция в очагах не проводится. Не подлежит
дезинфекции и транспорт по перевозке больных. В помещении проводится
ежедневная влажная уборка, максимальное разуплотнение в спальных
помещениях, облучение ультрафиолетовыми или бактерицидными лампами.
В период сезонного подъема заболеваемости запрещается большое
скопление детей на зрелищных мероприятиях, удлиняются перерывы между
сеансами в кинотеатрах.
Среди населения постоянно проводится широкая разъяснительная
работа о необходимости раннего обращения к врачу.
Глава 2
СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА
Менингококковая вакцина применяется с профилактической целью и
с целью экстренной профилактики в очагах менингококковой инфекции.
1. С профилактической целью менингококковой инфекции,
вызванной менингококком серогруппы A, вакцинация проводится на
территориях в период эпидемического неблагополучия при показателе
заболеваемости более 2,0 на 100000 населения.
Прививкам подлежат:
- дети от 1 года до 7 лет включительно;
- учащиеся первых курсов учреждений, обеспечивающих
профессионально-техническое, специальное и высшее образование,
временные рабочие и другие лица, приехавшие из разных местностей в
организованные коллективы и объединенные совместным проживанием в
общежитиях (желательно в период формирования коллективов);
- дети, принимаемые в детские дома, учащиеся первых классов
школ-интернатов.
При резком подъеме заболеваемости менингококками типа A и C
(показателе свыше 20,0 на 100000 населения) проводится массовая
вакцинация всего населения в возрасте до 20 лет.
2. С целью экстренной профилактики (для предотвращения новых
заболеваний) вакцина вводится в очаге инфекции в первые 5 дней после
выявления первого случая заболевания генерализованной формой
менингококковой инфекции.
Вакцинации подлежат:
- лица, находившиеся в контакте с больным в детском
учреждении, школьном классе, семье, квартире, комнате общежития и
других дружественных тесных контактах;
- лица, вновь поступающие в коллектив - очаг инфекции (вакцина
вводится им за неделю до поступления);
- учащиеся всего первого курса средних и высших учебных
заведений при возникновении заболеваний ГФМИ на первом курсе или на
старших курсах;
- учащиеся старших курсов, общавшиеся с больным в группе или
комнате общежития;
- проживающие в сельской местности дети, школьники, учащиеся,
а также все лица, находившиеся в любой степени общения с больными в
населенном пункте, где в течение последних 3 лет не регистрировались
заболевания.
Иммунизация осуществляется менингококковой вакциной,
зарегистрированной МЗ РБ, в соответствии с наставлением по
применению, не ранее чем через 1 месяц после введения других вакцин,
а в очагах инфекции - независимо от срока их введения. Вакцина
менингококковая полисахаридная может одновременно вводится в разных
шприцах с другими видами вакцин и анатоксинов, кроме БЦЖ и против
желтой лихорадки.
Повторная вакцинация одним и тем же лицам проводится не чаще
одного раза в 3 года.
В иммунизированных коллективах карантин не устанавливается,
бактериологическое обследование и иммуноглобулинопрофилактика
контактным старше 1 года не проводится.
Приложение 3
к приказу
Министерства
здравоохранения
Республики Беларусь
22.12.2004 № 286
ИНСТРУКЦИЯ
"Микробиологическая диагностика менингококковой
инфекции и бактериальных менингитов"
Глава 1
ПОКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ
Лабораторная диагностика менингококковой инфекции и гнойных
менингитов (ГМ) осуществляется бактериологическим методом путем
выделения и идентификации возбудителя, серологическим - путем
выявления специфических антигенов в жидкостях организма (ликвор,
кровь, синусоидальная жидкость и др.) или антител в сыворотке крови.
Лабораторное обследование проводят с диагностической целью и по
эпидемиологическим показаниям. С диагностической целью обследуют
больных с клинически выраженной формой заболевания, локализованной
формой (назофарингит) и с подозрением на менингококковую инфекцию и
менингиты иной этиологии.
По эпидемиологическим показаниям обследуют лиц, бывших в
контакте с больными менингококковой инфекцией.
Глава 2
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА МЕНИНГОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ
И ДРУГИХ ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ
В связи с тем, что наряду с менингококками, наиболее частыми
этиологическими факторами гнойных менингитов могут быть пневмококки,
а у детей младшего возраста - H.influenzae и др. возбудители,
представляется целесообразным изложение основных дифференциально-
диагностических признаков и методов выделения этих микроорганизмов.
По классификационной систематике бактерий Bergey (I том, 1994 г., 9-
е издание), менингококки принадлежат к семейству Neisseriaceae роду
Neisseria, к группе 4 - грамотрицательные аэробные / микрофильные
палочки и кокки и к подгруппе 4 А - Аэробы. Род нейссерий включает
два вида патогенных микроорганизмов: N.meningitidis и N.gonorrhoeae,
остальные представители этого рода являются резидентной флорой
слизистых оболочек. К последним относятся пигментообразующие,
объединенные в один вид N.subflava, а также N.sicca, N.mucosa,
N.flavescens, N.lactamica. Катаральный диплококк выделен в род
Moraxella и обозначен как Moraxella (Branhamella) catarrhalis.
Менингококки требовательны к условиям культивирования. При
росте требуют повышенной влажности и 5 - 10% содержания CO2 в
воздухе, чувствительны к малейшим отклонениям температуры. В
качестве источника нативного белка рекомендуется применять сыворотку
крупного рогатого скота, лошадиную или кровь различного
происхождения.
Основой для приготовления сред могут служить бульоны на основе
гидролизата мяса по Хоттингеру, "эритрит-агар", агар АГВ, сухой
питательный агар специального назначения и аминопептид для
микробиологических питательных сред (жидкий). Сухие питательные
агары, а также сыворотки крови должны быть обязательно проверены на
пригодность для культивирования менингококка. Проверку необходимо
проводить со свежевыделенной культурой или эталонным штаммом
менингококка, хранившимся в высушенном состоянии.
Идентификация вида N.meningitidis основана на комплексе
морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических
признаков (таблица 1). При первом выделении менингококкам
свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и
разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии
менингококков на сывороточном агаре бесцветные, круглые с ровным
краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию,
легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний
непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся
консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из спинномозговой
жидкости (СМЖ), могут обладать слабой ферментативной активностью в
отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство
непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при
выращивании на сывороточном агаре с 5% сахарозы образовывать
крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью
водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания
культуры.
Менингококки делятся на следующие серогруппы: A, B, C, X, Y,
Z, 29Е, Д, 135W, К, Н. Проведение серологического группирования
менингококков является обязательным для практических лабораторий как
одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой
инфекцией.
Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям
и М.catarrhalis в отличии от гемофилов и пневмококков, что может
служить дифференцирующим признаком при идентификации в сочетании с
другими (таблица 2).
Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются
высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве
фактора, способствующего их росту используют кровь различного
происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей
может служить "шоколадный" агар. Заболевания, где этиологическим
агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным
механизмом передачи, что способствует их широкому распространению.
Среди видов гемофильных бактерий, наибольшей патогенностью обладает
Н.
Этот возбудитель имеет несколько специфических сероваров: a,
b, c, из которых ведущую роль в этиологии генерализованных гнойно-
септических инфекций играет инкапсулированная форма серовара "b"
(Hib), относящейся к биотипу 1.
Для проведения достоверной бактериологической диагностики
гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор
материала от больных в полном объеме с соблюдением сроков забора,
доставки патологического материала и условий транспортировки.
Материал для бактериологических и серологических исследований
доставляются в бактериологическую лабораторию немедленно после
забора в специально оборудованных контейнерах при температуре 37
град. C.
При невозможности немедленной доставки допускается хранение
патологического материала в условиях термостата при температуре 37
град. C в течение 18 часов.
В бактериологическую лабораторию материал доставляется в
следующем объеме:
1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и
серологических исследований в количестве не менее 2,0 мл.
2. Ликвор в 0,1% полужидком агаре (среда обогащения) для
бактериологического накопления культуры; 0,5 мл ликвора засевают в
5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.
3. "Толстая капля" крови для бактериоскопии.
4. Кровь в жидкой питательной среде - 5,0 мл крови засевают в
0,1% полужидкий агар (среда обогащения).
5. Кровь в количестве не менее 2,0 мл для серологических
исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.).
Глава 3
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПИННОМОЗГОВОЙ
ЖИДКОСТИ БОЛЬНОГО
1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в
количестве 2 - 5 мл берут у больного сразу же при поступлении в
стационар с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора
проводится персоналом в масках.
Первую порцию СМЖ (около 1 мл) берут в отдельную пробирку для
проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию,
предназначенную для бактериологического исследования, забирают в
стерильную центрифужную или агглютинационную пробирку. Касаться
руками краев канюли, иглы и краев пробирки нельзя. Ватно-марлевую
пробку полагается держать на весу за ее наружную часть. Если
немедленно доставить жидкость в лабораторию невозможно, допустимо
хранение ее в течение нескольких часов в термостате при температуре
37 град. C. Во время транспортировки СМЖ следует тщательно
предохранять от охлаждения. СМЖ исследуют немедленно при доставке в
лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут
0,3 - 0,5 мл материала и по 2 - 3 капли засевают на поверхность 2
чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна
чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы
ставят в термостат при 37 град. C и создают условия повышенного
содержания CO2 в атмосфере термостата.
Спинномозговую жидкость, оставшуюся в пробирке, используют для
посева на среду "обогащения" (полужидкий агар) и одновременно в
реакции встречного иммуноэлектрофореза.
Оставшийся материал используют для приготовления мазков.
Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно
четко, поэтому они окрашиваются метиленовой синью или по Граму в
следующем порядке:
- окрашивают препарат бумагой по Синеву 1 - 2 минуты;
- смывают краску раствором Люголя;
- обрабатывают препарат раствором Люголя 1 - 2 минуты;
- смывают раствор Люголя йод-ацетоном;
- обесцвечивают препарат йод-ацетоном 30 секунд;
- промывают препарат водой;
- докрашивают 1% раствором сафранина 2 минуты;
- промывают водой, просушивают, микроскопируют.
Для приготовления обесцвечивающего раствора йод-ацетона
необходимы реактив Фортиса (йод кристаллический - 10 гр, йодистый
калий - 6 гр, спирт - 90 мл) - 3,5 мл и ацетон - 96,5 мл.
Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в
известной части случаев позволяет установить наличие бактерий,
вызывающих гнойный менингит. Морфология менингококков описана выше.
H.influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных
палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.
Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких
цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся
всеми анилиновыми красками, при этом капсула остается неокрашенной и
заметна только на окрашенном фоне. Результаты бактериоскопии
немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа.
При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2 -
3 капли засеять на чашку с питательной средой для определения
чувствительности к антибиотикам.
Необходимо определить возможность выдачи окончательного ответа
на данном этапе исследования при положительной реакции со
специфическими сыворотками для Н.
2-й день исследования. Независимо от результатов
бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек
ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического
микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с
отсутствием роста инкубируют дополнительно одни сутки. Готовят
препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором KOH и
биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам
присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.
Менингококковые колонии на "шоколадном" агаре имеют сероватый
цвет, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую
консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют
цвета среды. На основании микроскопии мазков из колоний и
результатов первичных биологических тестов возможна выдача
предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные
кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести
дифференциацию видов.
Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост.
Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2 - 2,0 мм, легко
снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие
короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени
выраженности, а также нити разной длины, и короткие цепочки. На
сывороточном агаре H.influenzae не растет. Крупные (3 - 5 мм)
колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на
энтеробактерии. Candida и P.aeruginosa растут обильно на всех
средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.
Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (диаметром 0,1 -
1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном"
агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемо-
лиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно
отличить от колоний стрептококков группы B, зеленящих стрептококков,
энтерококков (S.feacalis), которые в редких случаях могут вызывать
менингит, особенно у детей 1 года. В мазках из колоний пневмококки
имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде
коротких цепочек из 2 - 3 пар.
Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим
одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды,
изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительность
(таблица 1, 2). Определение чувствительности энтеробактерий и
стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для
определения чувствительности к антибиотикам менингококков, при
добавлении 20% сыворотки, H.influenzae и пневмококков - при
добавлении соответствующего количества крови. Приготовление
питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность
производится в соответствии с действующими указаниями.
В таблице 2 суммировано минимальное число признаков,
достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии
предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до
вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе
возможна выдача предварительного (а для H.influenzae окончательного)
ответа.
Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный
сывороточный агар или сектор в чашке Петри на бессывороточный агар и
инкубируют в термостате при 37 град. C. Колонии, подозрительные на
пневмококки и др. стрептококки, отсевают на 2 сектора кровяного
агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к
желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.
Если число выросших колоний мало (1 - 2), то их отсевают на
чашку Петри с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления
микробной массы, идентификацию микробов проводят еще через одни
сутки.
При гнойных менингитах у новорожденных и детей раннего
возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех
перечисленных видов микроорганизмов этиологическим фактором могут
быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Saimonella,
Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa,
Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes), различные
стрептококки - гемолитические группы B, "зеленящие" и энтерококки, а
также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода
Candida.
При подозрении на энтеробактерии, синегнойную палочку,
стафилококк и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии
с имеющимися методическими материалами.
При подозрении на листерии в этот день, если число колоний
позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к
антибиотикам. Для L.monocytogenes помимо признаков, указанных в
таблице 2, характерно: подвижность при комнатной температуре,
разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту,
манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются
медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с
5% бараньей крови, разлитой слоем 3 мм.
Для идентификации Candida albicans делают посев из
подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих их дрожжевых
клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100
МЕ/мл пенициллина и стрептомицина.
Если прямой посев в питательную среду не дал роста, то
делается высев из инкубированной в термостате при 37 град. C СМЖ в
полужидком агаре (среда "обогащения") на чашки Петри с сывороточным
и "шоколадным" агаром.
При отрицательных результатах высев со среды "обогащения"
повторяют через 1 - 2 дня в течение 7 дней инкубации в термостате.
При получении роста колоний исследование их проводят тем же
путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.
3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных
колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором KOH.
Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают.
При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков,
проводят идентификацию (таблица 1), серогруппирование
идентифицированной культуры, а также используют эту культуру для
определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были
сделаны на 2-й день).
Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день
исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного
положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме
пневмококков и стрептококков).
Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных
стрептококков (энтерококков) после микроскопии чистых культур на
секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших
колоний и ставят дополнительные пробы (таблица 3).
На один из двух секторов кровяного агара с ростом колоний
накладывают диск из фильтровальной бумаги, пропитанной 20% раствором
желчи (на физиологическом растворе), после чего чашку помещают при
37 град. C на 1 - 2 часа. По истечении этого времени вокруг диска
колонии пневмококков лизируются, образуя зону отсутствия роста
шириной 1 - 2 мм, в то время как рост прочих стрептококков остается
интактным. При положительной пробе чувствительности к желчи, при
условии типичной морфологии клеток и колоний, можно дать
положительный ответ о выделении пневмококков. Рост культуры на 2-м
секторе кровяного агара используют для постановки пробы на
чувствительность к лекарственным препаратам (если это не было
сделано ранее).
При отрицательных результатах пробы на чувствительность к
желчи, рост на 2-м секторе используют не только для испытания
чувствительности к химиопрепаратам, но и для постановки ряда тестов,
дифференцирующих стрептококки (таблица 3).
В этот же день ставят пробы для идентификации других возможных
возбудителей, а также тест на лекарственную чувствительность (если
это не было сделано на 2-й день).
4-й день исследования. Учитывают результаты посевов с целью
дифференциации менингококков от непатогенных нейссерий и
M.catarrhalis и чувствительности к химиопрепаратам (если это не было
сделано на 3-и сутки). Возможна выдача положительного ответа.
Культуру менингококков, выросшую на сывороточном агаре при
температуре 37 град. C, можно использовать для серологической
идентификации менингококков в реакции агглютинации или в реакции
преципитации в агаре, а также для определения лекарственной
устойчивости.
Учитывают результаты проб на лекарственную чувствительность и
прочие свойства у других возбудителей, выдают окончательный
положительный ответ.
При выделении возбудителя только с помощью метода обогащения
окончательный положительный ответ выдается позднее (в зависимости от
длительности инкубации "обогащенных" посевов в термостате).
Глава 4
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КРОВИ
При подозрении на менингококкцемию или сепсис проводят
бактериологическое исследование крови. В качестве экспресс-метода
диагностики рекомендуется приготовление мазка "толстой капли" крови
на менингококк, взятой из вены или пальца.
В препарате "толстой капли" менингококки имеют преимущественно
такую же морфологию, как в спинномозговой жидкости, но чаще
располагаются поодиночке, имеют более круглую форму. В мазке,
имеющем голубой фон, хорошо видны окрашенные в темно-синий цвет
лейкоциты и между ними множество мелких, темно-синих,
располагающихся кучками, парно и по одному, кокков, как вне, так и
внутриклеточно. Результаты бактериоскопии немедленно сообщают
лечащему врачу в виде предварительного ответа.
Несколько капель крови, взятой стерильно из вены, засевают на
чашки с вышеуказанными питательными средами, а затем на 0,1%
полужидкий агар в отношении 1:10, т.е. 1 - 2 мл крови засевают в
пробирку с 7 - 10 мл полужидкого агара или 5 - 10 мл крови засевают
во флакон с 50 мл питательной среды, подогретой до 37 град. C. После
суточной инкубации материал высевают на сывороточный и "шоколадный"
агары в чашки Петри. При отрицательном результате рекомендуется
инкубация в течение недели с ежедневными или через день высевами.
Выделение и идентификацию гемокультур проводят так же, как и при
исследовании спинномозговой жидкости.
Глава 5
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
НОСОГЛОТОЧНОЙ СЛИЗИ НА МЕНИНГОКОККИ
1-й день исследования. Исследуемый материал - слизь с задней
стенки носоглотки - берут натощак или через 3 - 4 часа после еды
стерильным ватным тампоном, укрепленным на изогнутой проволоке.
Материал берут с обязательным надавливанием шпателем на корень
языка. Тампон вводят концом к верху за мягкое небо в носоглотку и
проводят 2 - 3 раза по задней стенке. При извлечении тампон не
должен касаться зубов, слизистой щек, языка и язычка.
Материал может быть засеян на месте его взятия на чашку Петри
с питательной средой, или погружен в пробирку с транспортной средой,
или средой обогащения, или взят смоченным тампоном (п. 9.4), который
затем доставляют в лабораторию. При посеве на чашку материал втирают
по поверхности небольшого участка (1 x 2 см) среды всеми сторонами
тампона, затем этим же тампоном засевают штрихами (с отрывом) по
всей площади, отведенной для посева.
Используют сывороточный агар с добавлением в него
антибиотиков, подавляющих рост грамположительных кокков. Для этой
цели применяется ристомицин или линкомицин в оптимальной
концентрации. На одну чашку можно засеять две пробы. Однако
встречаются отдельные штаммы менингококков, более чувствительные к
линкомицину, поэтому те же пробы одновременно засевают на половину
чашки с сывороточным агаром без линкомицина.
При отсутствии линкомицина или ристомицина можно использовать
диски с этими антибиотиками. Диски (не более 2) накладывают
непосредственно на поверхность засеянного сывороточного агара. В
этом случае на 1 чашку сеют только одну пробу. Через сутки вокруг
диска, в зоне 1 см, рост грамположительной флоры будет подавлен, что
увеличивает возможность выделения колоний нейссерий.
Засеянные чашки доставляют в лабораторию, в контейнерах,
поддерживая температуру 33 - 40 град. C, тщательно защищая их от
охлаждения, в зимнее время применяя грелки (35 - 40 град. C), и
немедленно помещают в термостат при температуре 37 град. C на 24 -
48 часов.
Тампоны с исследуемым материалом, погруженные в полужидкую или
транспортную среду, доставляют в лабораторию, также тщательно
защищенными от охлаждения. Тампоны в 0,1% полужидком агаре (среда
обогащения) помещают в термостат для подращивания микрофлоры.
Смоченные тампоны или тампоны в транспортной бульонной среде
засевают на чашку с сывороточным агаром, лишенным ингибитора, без
предварительного проращивания. Посев делают отжатым тампоном, как
описано выше. Засеянные чашки помещают в термостат при температуре
37 град. C.
При транспортировке материала в течение 1 - 2 часов применение
транспортных сред не рекомендуется. При транспортировке в течение 2
- 4 часов уместно применение тампонов, смоченных питательной средой.
При транспортировке в течение 3 часов и более используют
транспортную среду.
Полужидкая среда обогащения может использоваться независимо от
срока транспортировки.
2-й день исследования. Просматривают чашки, засеянные
накануне, визуально и под лупой-микроскопом МБС, подозрительные
колонии отсевают на секторы чашки с сывороточным агаром (не менее 3
- 5 колоний). Внешний вид колоний менингококков описан выше (п. 3).
На средах с ингибиторами вырастают только грамотрицательные
бактерии, преимущественно представители нейссерий. При отсутствии
роста в чашках с антибиотиками проводят повторный просмотр их через
40 - 48 часов после посева. Делают высев из полужидкой (0,1%) среды
обогащения на чашку с сывороточным агаром без ингибитора.
3-й день исследования. Изучают рост чистых культур, отсеянных
из отдельных колоний в предыдущий день. Культуры, колонии которых
имеют желтый пигмент различной интенсивности, а также
характеризующиеся "сухим" ростом, отбрасывают. Следует иметь в виду,
что на сывороточном агаре колонии менингококков могут выглядеть
желтоватыми из-за оттенка среды. Поэтому для обнаружения пигмента их
необходимо просматривать при дневном освещении.
Для дальнейшего исследования на менингококки оставляют только
непигментированные культуры, дающие нежный влажный рост. Из них
готовят мазки, проводят микроскопию чистой культуры. В первых
генерациях для менингококков характерны полиморфизм и вариабельность
окраски, что не наблюдается у непатогенных нейссерий. После
микроскопии дальнейшую идентификацию культур проводят по
вышеописанным тестам.
Если рост культуры из отсеянных колоний достаточно обильный,
то в эти сутки ставят реакцию агглютинации с группоспецифическими
сыворотками.
4-й день исследования. Просматривают посевы. Учитывают
результаты роста на бессывороточном и желчном агаре (при температуре
37 град. C), сахаролитическую активность, ставят реакцию с водным
раствором Люголя на продукцию полисахарида, проводят окончательную
серологическую идентификацию менингококков по реакции агглютинации.
В этот же день выдают окончательный положительный или
отрицательный ответ. Результаты бактериологического исследования с
полужидкой среды соответственно будут получены на сутки позднее.
Глава 6
ИССЛЕДОВАНИЕ ТРУПНОГО МАТЕРИАЛА
Патологоанатомическое вскрытие желательно проводить в наиболее
ранние сроки после смерти. Для бактериологического исследования
направляют кровь, ликвор, кусочки головного мозга (или гной, взятый
тампоном с мягкой мозговой оболочки, в случаях менингококцемии - из
печени, селезенки, легкого, надпочечников и т.д.). Кровь берут
стерильно из правого сердца, после вскрытия скальпелем, с помощью
стерильной пипетки с грушей в количестве 7 - 10 мл. Из них 2 - 3 мл
засевают в 25 мл 0,1% полужидкого агара, а оставшиеся 5 - 7 мл
используют для других исследований (серологических, в ВИЭФ и т.д.).
Для посевов можно использовать также сгустки крови из крупных
сосудов.
Ликвор берут стерильной пипеткой из околооболочечного
пространства (во время извлечения головного мозга из полости
черепа), в стерильную пробирку в количестве 3 - 5 мл и немедленно
высевают на чашки с питательными средами. В количестве 0,1 мл
исследуемый материал наносят в центр чашки и распределяют по ее
поверхности покачиванием, растирать не рекомендуется.
Бактериологическое исследование ликвора и крови проводят в
соответствии с разделами 3 и 4 данной инструкции. Надо иметь в виду,
что рост на чашках может быть смешанным из-за попадания посторонней
микрофлоры, поэтому к общепринятому набору питательных сред следует
добавить чашку сывороточного агара с антибиотиком (ристомицин,
линкомицин).
Гной с мозговых оболочек берут стерильным ватным тампоном и
засевают газоном или штрихами на чашки с шоколадным сывороточным
агаром и в пробирку со средой обогащения, делают 2 мазка на
предметных стеклах, один из которых красят метиленовым синим, другой
- по Граму.
Для взятия материала из мозга и других органов к месту разреза
прикасаются раскаленным шпателем, материал берут из глубины разреза
стерильным ватным тампоном. Посев производят обычным способом на те
же плотные и жидкие питательные среды. Выросшие культуры
дифференцируют в соответствии с разделом 3 данной инструкции.
Помимо посевов из мозга, целесообразно проводить изучение
мазков-отпечатков с поверхности мягких мозговых оболочек. После
просушивания и фиксации над пламенем горелки (при длительном
хранении - в ацетоне) мазки окрашивают и просматривают.
Глава 7
СОХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА ВЫДЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР
Идентифицированные культуры уничтожают или передают по
требованию в ГУ "Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и
общественного здоровья", ГУ "Научно-исследовательский институт
эпидемиологии и микробиологии".
N.meningitidis, Str.pneumoniae быстро гибнут во внешней среде.
Их можно сохранить в течение 5 - 6 недель методом посева на столбики
из оптимальных для каждого микроорганизма питательных сред:
N.meningitidis - сывороточный агар, для Str.pneumoniae - кровяной
агар. Культуру засевают уколом в столбики и ставят в термостат при
температуре 37 град. C. Через 24 часа при появлении роста культуры
по ходу укола и в виде бляшки на поверхности среды в пробирку
наливают 1,5 - 2 мл стерильного вазелинового масла и в таком виде
хранят, транспортируют, не допуская охлаждения. Засеянный материал
из одной пробирки можно использовать многократно для пересева. Для
сохранения культуры пневмококков ее засевают на скошенный кровяной
агар и выращивают в течение 4 - 6 дней при температуре от +4 град. C
до +22 град. C. Для получения свежей культуры с поверхности
засеянного агара делают соскоб петлей и пересевают на свежую среду
такого же состава, ставят в термостат на сутки при температуре 37
град. C.
Группоспецифическая активность менингококков сохраняется в
течение 2 недель, а пневмококков - 1 недели.
Н.influenzae также быстро гибнет. Жизнеспособность гемофилов
можно продлить до 1 месяца, для чего делают обильный посев на
скошенный "шоколадный" агар и после суточной инкубации создают
полную герметизацию. Такую культуру для пересева используют
однократно. Дегерметизация приводит к гибели субкультуры.
Глава 8
СРОКИ ВЫДАЧИ ОТВЕТОВ И ИХ ФОРМУЛИРОВКА
При бактериологическом исследовании ликвора и крови сроки
выдачи и формулировка ответов таковы:
на 1-й день на основании прямой бактериоскопии ликвора и
толстой капли крови дают предварительный ответ, в зависимости от
результата он формируется в трех вариантах:
а) при наличии в мазках большого числа морфологически типичных
бактерий пишут: "В спинномозговой жидкости (крови) при прямой
бактериоскопии обнаружены грамотрицательные кокки (или
грамположительные кокки или грамотрицательные палочки), сходные по
морфологии с менингококками, или пневмококками, или Н.influenzae.
Исследование продолжается";
б) при наличии в мазках единичных бактерий пишут: "В
спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии обнаружены
единичные (или парные) клетки кокков (или палочек и т.д.).
Исследование продолжается";
в) при отсутствии каких-либо бактериальных клеток пишут: "В
спинномозговой жидкости (крови) при прямой бактериоскопии бактерий
не обнаружено".
На основании реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ),
ликвора дают ответ, который в зависимости от результата формируют в
трех вариантах:
а) при наличии линий преципитации с одной из
группоспецифических антименингококковых сывороток пишут: "В
спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза
(ВИЭФ) выявлен специфический антиген серогруппы A (или другой
серогруппы)";
б) при наличии линий преципитации с несколькими
группоспецифическими антименингококковыми сыворотками пишут: "В
спинномозговой жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза
(ВИЭФ) выявлены менингококковые антигены";
в) при отсутствии линий преципитации пишут: "В спинномозговой
жидкости в реакции встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ)
специфические менингококковые антигены не выявлены".
На 2-й день выдают ответ также предварительного характера,
который в зависимости от результатов бактериологического
исследования формулируют следующим образом:
а) при росте бактерий, типичных по морфологическим и
культуральным свойствам для нейссерий и других родов, пишут: "При
прямом посеве спинномозговой жидкости (крови) получен рост нейссерий
(стафилококков, стрептококков, грамотрицательных палочек и др.).
Изучение культуры продолжается";
б) при обнаружении роста и идентификации Н.influenzae пишут
"При посеве спинномозговой жидкости получен рост Н.influenzae";
в) при отсутствии роста пишут: "При прямом высеве
спинномозговой жидкости (крови) роста бактерий не обнаружено.
Исследование продолжается".
На 3-й день на основании культурально-биохимических свойств
бактерий, отсеянных с чашки на 2-й день, выдают окончательный ответ:
"Из спинномозговой жидкости (крови) выделена культура менингококков
серогруппы A, B и т.п. или нетипируемые. В редчайших случаях
"M.catarrhalis" или "непатогенные нейссерии".
В этот же день может быть дан предварительный ответ о росте
(или его отсутствии) бактерий в результате высева из среды
обогащения. Формулировка та же, что и при оценке результатов прямого
посева с чашки. В этот же день выдают окончательный положительный
ответ на пневмококки, который формулируют: "Из спинномозговой
жидкости (крови) выделена культура Str.pneumoniae".
На 4-й день может быть выдан окончательный положительный ответ
о видовой принадлежности нейссерий, выросших при прямом посеве, а
также других бактерий.
На этом этапе, как и в следующие дни (вплоть до 7 - 8 дня),
может быть выдан окончательный положительный ответ, полученный в
результате высева из среды обогащения. Формулировка та же (см. 3-й
день).
Окончательный отрицательный ответ выдают не ранее 7-го дня,
когда при последнем высеве из среды обогащения (на 7-й день ее
инкубации) не обнаруживают роста бактерий. Его формулировка: "При
инкубации спинномозговой жидкости (крови) на среде обогащения в
течение 7 дней бактерий выделить не удалось".
При бактериологическом исследовании отпечатков - кусочков
ткани трупного материала, крови, жидкости из полостей дают
предварительный ответ, который в зависимости от результатов
формулируется в трех вышеназванных вариантах.
Окончательный отрицательный ответ выдается не ранее 8-го дня с
момента посева исследуемого материала.
При бактериологическом исследовании слизи из носоглотки выдают
только окончательные ответы. Сроки выдачи и формулировки следующие:
на 4-й день при выделении культуры менингококка выдают положительный
ответ: "В носоглоточной слизи обнаружены менингококки серогруппы ...
или нетипируемые".
В случаях добавочного отсева колоний с чашек, а также при
использовании полужидкой среды обогащения сроки выдачи ответа
соответственно отодвигаются на сутки. При отсутствии роста
менингококков в посевах выдают отрицательный ответ: "В носоглоточной
слизи менингококки не обнаружены".
Глава 9
ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСОК, ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ОПИСАНИЕ МЕТОДОВ
Приготовленные среды годны к употреблению только в течение 48
часов при хранении ее в холодильнике. Перед посевом чашки,
хранившееся в холодильнике, должны быть подсушены и подогреты до
температуры 37 град. C.
9.1. Сывороточный агар с ристомицином.
К 80 мл расплавленного и остуженного агара (основа для
приготовления сывороточного агара) добавляют 20 мл сыворотки и 0,1
мл раствора ристомицина, содержащего 20000 ед/мл (конечная
концентрация антибиотика 20 ед/мл питательной среды).
В связи с испытываемыми трудностями в снабжении ристомицином
рекомендуется простой метод, позволяющий экономно расходовать
антибиотик. Препарат разводят стерильным физиологическим раствором
до рабочей концентрации и затем разливают по стерильным
пенициллиновым флаконам или центрифужным пробиркам под ватными или
резиновыми пробками и замораживают в морозильной камере. Количество
рабочего раствора во флаконах или пробирках зависит от потребности
лаборатории.
Рабочий раствор сохраняют в морозильной камере до момента
использования. В случае необходимости раствор оттаивают и добавляют
в среду. Например, во флакон, содержащий 100 мг (100000 ед.)
ристомицина, вносят 5 мл стерильного физиологического раствора.
Полученное разведение препарата является рабочим. Его удобно разлить
по 0,5 мл и заморозить. В таком состоянии препарат может храниться
несколько месяцев.
9.2. Сывороточный агар с линкомицином.
К 80 мл расплавленного и остуженного агара добавляют 20 мл
сыворотки и 0,5 мл раствора линкомицина в концентрации 1000 мкг/мл.
Конечная концентрация антибиотика в среде - 5 мкг/мл
питательной среды. Раствор линкомицина можно хранить при температуре
+4 град. C в течение 6 месяцев.
9.3. Желчно-сывороточный агар.
5,0 сухой бычьей желчи растворяют в 100,0 мл дистиллированной
воды, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, доводят pH до 7,2 -
7,4, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд. К 80 мл расплавленного
и охлажденного до 50 град. C питательного агара добавляют 4,0 мл
стерильного раствора желчи, перемешивают, затем добавляют 20,0 мл
сыворотки животных, снова хорошо перемешивают и разливают по чашкам
Петри. Конечная концентрация желчи в среде - 0,2%. Посев испытуемых
культур нейссерий производят штрихами на сектора чашки.
9.4. Бульон для приготовления смоченных тампонов.
Бульон готовят на любой питательной основе с добавлением 20%
сыворотки животных и ристомицина из расчета 20 ед/мл среды. Для
отбора материала используют ватные тампоны на алюминиевых стержнях,
вмонтированные в пробирку. Перед выездом за материалом тампоны
пропитывают бульоном из расчета 10 - 12 тампонов в 5 мл бульона,
соблюдая стерильность. Тампоны помещают в контейнеры, где
поддерживается температура 33 - 40 град. C. Длительность
транспортировки материала с момента взятия до посева в питательную
среду не должна превышать 3 часов.
9.5. Приготовление жидких транспортных сред с линкомицином.
Используют любой питательный бульон или 2% пептонную воду pH =
7,2 - 7,6. К 100 мл стерильного бульона добавляют 0,5 мл линкомицина
в концентрации 1000 мкг/мл. Конечная концентрация линкомицина - 5
мкг/мл. Среда сохраняется в холодильнике не более 2 суток.
Непосредственно перед взятием носоглоточной слизи (можно в
помещении, где находятся обследуемые лица) среда без огня
разливается по 1,0 мл в стерильные пробирки. Перед погружением
тампона пробку извлекают, тампон вставляют в пробирку так, чтобы
материал был погружен в среду; пробирку со вставленным тампоном
снова закрывают. Пробирки транспортируют в вертикальном положении
при температуре не ниже 22 град. C. При доставке в лабораторию
тампоны отжимают о стенки пробирки и производят посев на
сывороточный агар без антибиотиков в чашки Петри. На одной чашке
можно разместить 2 посева. Транспортные среды с линкомицином
применяют при отсутствии возможности доставить материал в
лабораторию в течение 3 часов.
9.6. Приготовление полужидкой среды обогащения для
носоглоточной слизи.
К 80 мл полужидкого питательного агара добавляют 20 мл любой
сыворотки и 0,1 мл раствора ристомицина, содержащего 20000 ед/мл
(конечная концентрация 20 ед/мл питательной среды). Среду разливают
в пробирки по 3 мл, выдерживают 2 суток в термостате для контроля и
затем хранят в холодильнике.
Глава 10
МЕТОДЫ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ
МЕНИНГОКОККОВ ИЛИ ИХ АНТИГЕНОВ
10.1. Реакция агглютинации на стекле проводится в соответствии
с инструкцией по применению сывороток.
10.2. Реакция агглютинации в полистироловых пластинах.
При серологическом группировании менингококковых штаммов,
особенно носоглоточных, часто наблюдается ауто- или
полиагглютинация. Чтобы снять поли- и аутоагглютинацию необходимо
при постановке РА использовать микробную взвесь. Для этого
рекомендуем полистироловые пластины или большие стекла, на которых
капли ограничивают карандашом по стеклу. Для каждой испытуемой
культуры менингококков используют 1 ряд лунок пластины. Число
горизонтальных лунок соответствует числу агглютинирующих
группоспецифических сывороток. Жидкую сыворотку каждой серогруппы в
лунке разводят вдвое (1 капля сыворотки плюс 1 капля взвеси
культуры). В отдельной лунке каждого ряда готовят взвесь испытуемых
культур. Необходимая густота взвеси обеспечивается сливным ростом
колоний на 1/8 - 1/10 части чашки Петри. Запаянной изогнутой
пастеровской пипеткой бактериальную массу снимают и тщательно
эмульгируют, вначале в 2 каплях физиологического раствора,
внесенного заранее в лунку. Затем для получения оптимальной рабочей
густоты к взвеси добавляют до 1,0 мл физиологического раствора.
Взвесь разносят по 1 капле в горизонтальные лунки. Пластины
встряхивают в течение 1 минуты вручную или в шуттеле-аппарате.
Специфическую реакцию выявляют и учитывают в течение 3 минут.
Более поздний учет не исключает наличия реакции за счет перекрестно
реагирующих антигенов. Контролем служит лунка, в которой готовили
исходную взвесь бактерий в физиологическом растворе.
Заключение о принадлежности культуры к той или иной серогруппе
производят на основании положительной реакции агглютинации с
соответствующей сывороткой по 4-плюсовой шкале (при отсутствии
агглютинации в физиологическом растворе).
При наличии реакции агглютинации с несколькими сыворотками
серогруппу микробов определяют по наибольшему титру реакции
агглютинации с одной из сывороток, взятых в разведении 1:2, 1:4,
1:8. В случае реакции с несколькими сыворотками, одинаковой
интенсивности, культуру определяют как полиагглютинабельную. В этих
случаях серогруппирование проводят в реакции преципитации.
Использованные полистироловые пластины замачивают на 1 час в 3%
растворе карболовой кислоты, а затем моют обычным способом.
10.3. Реакция преципитации для определения серогруппы
менингококков и метод встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) для
определения группоспецифического менингококкового антигена в СМЖ
(экспресс-диагностика).
10.3.1. Приготовление агара.
Из дальневосточных сортов агар-агара готовят 2% взвесь на
дистиллированной воде. В случае непрозрачного раствора агара, в него
добавляют 10% раствор CaCl2 из расчета 50 мл на 1 л раствора агара.
Профильтрованный растопленный агар разливают в ванночки слоем в 1
см, в застывшем состоянии нарезают квадраты размером 1 x 1 см и
завязывают в марлю. Сначала его промывают проточной водопроводной
водой в течение 24 - 48 часов, затем на сутки помещают в
дистиллированную воду, которую заменяют 3 - 4 раза. Отмытый агар
отжимают от воды, помещают в колбу и разогревают на кипящей водяной
бане, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют
дистиллированную воду до первоначального объема, т.е. до
концентрации, равной 2%. К горячему 2% агару добавляют равный объем
"камерного" веронал-медиланового буфера, разведенного в 2 раза
дистиллированной водой, и кипятят в водяной бане до полной
гомогенизации смеси. К остывшему до 60 град. C агару добавляют тимол
или крезол из расчета 1:10000. Полученный 1% раствор агара на
веронал-медилановом буфере используют для постановки реакции ВИЭФ.
Для реакции микропреципитации используют 1% агар, приготовленный на
физиологическом растворе.
10.3.2. Реакция микропреципитации для определения серогруппы
менингококков.
В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 x 12 см
наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1%
агара на физиологическом растворе. В застывшем агаре с помощью
металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из
которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или
острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см.
Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную
лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические -
подогретые при температуре 100 град. C в течение 15 минут взвеси
испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в
холодильнике в течение 2 недель. Для реакции микропреципитации
используют неразведенные сыворотки.
Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка,
выращенной на 20% сывороточном агаре, должна составлять 30 - 60
единиц, т.е. быть в 3 - 6 раз гуще оптического стандарта мутности в
10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками,
заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру
(эксикатор с водой) на 24 - 48 часов при температуре 20 - 22 град.
C. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только
со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде 1 - 2 линий
преципитации.
10.3.3. Метод ВИЭФ.
У больного гнойным менингитом, желательно до применения
химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие
специфического полисахаридного антигена. Для этого используют
аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или любой другой марки. В
аппарат заливают "камерный" веронал-мединаловый буфер, содержащий в
1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 г веронала (веронал
надо греть на водяной бане до полного его растворения), pH = 8,6.
Приготовленный 1% агар, растопленный и остуженный до 60 град. C,
наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки,
размером 9 x 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После
застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр
которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстий на
расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды
располагают перпендикулярно к направлению силы тока.
Менингококковые антисыворотки разных серогрупп вносят в лунки,
расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в
лунки со стороны катода (-). Сыворотку каждой серогруппы вносят в
отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный
контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В
качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы A с
гомологичной сывороткой, в концентрации 10 - 20 мкг/мл.
Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммунофореза на 20 -
30 минут при силе тока 12 - 15 мА на 1 стекле. Аппарат работает при
комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин после
включения тока между лунками (с одной из сывороток и ликвором)
появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем
свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются
на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для
ускорения этого процесса в тот же день можно 2 - 3 раза пропускать
ток через пластину в течение 5 - 10 минут, т.е. время анализа
увеличивается до 60 мин.
Глава 11
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ТАМПОНОВ
ДЛЯ ВЗЯТИЯ НОСОГЛОТОЧНОЙ СЛИЗИ
Для взятия носоглоточной слизи используют ватные тампоны,
укрепленные на металлической проволоке. Лучше всего применять
проволоку из малоокисляемого металла (алюминия) диаметром 2 - 3 мм.
Проволоку изгибают под углом 135 град. на расстоянии 1 - 2 см от
конца, на который накручивают ватный тампон; 5 - 10 таких проволок
завертывают в бумагу и стерилизуют сухим жаром или в автоклаве.
Можно использовать также стерильные ватные тампоны на проволоках,
вмонтированных в пробирку.
Глава 12
СОЗДАНИЕ ПОВЫШЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ УГЛЕКИСЛОТЫ ПРИ
КУЛЬТИВИРОВАНИИ ПОСЕВОВ НА ЧАШКАХ ПЕТРИ И В ПРОБИРКАХ
(РЕКОМЕНДУЕТСЯ ПРИ ПЕРВИЧНОМ ВЫДЕЛЕНИИ МЕНИНГОКОККОВ
ИЗ ЛИКВОРА И ПОЛУЧЕНИИ БИОМАССЫ)
Для создания повышенной концентрации CO2 можно использовать
любой сосуд с притертой крышкой, например, эксикатор. Засеянные
чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же укрепляют зажженную
свечу высотой 2 - 3 см и закрывают крышкой, которой может служить и
простое большое стекло. К моменту затухания свечи в сосуде создается
повышенная концентрация CO2 (7 - 10%). После этого сосуд с посевами
помещают в термостат.
Таблица 1
Культуральные и биохимические свойства
нейссерий и M.catarrhalis
---------------T-----------------------T---------T--------T---------------------------T------------T-------------¬
¦Возбудитель ¦Отношение к условиям ¦Зависи- ¦Образо- ¦Сахаралитическая активность¦Образование ¦Редукция ¦
¦ ¦культивирования ¦мость ¦вание ¦ ¦полисахарида+------T------+
¦ +-----------------------+роста от ¦пигмента¦ ¦на агаре с ¦нитра-¦нитри-¦
¦ ¦Рост на ¦CO2 при ¦ ¦ ¦5% сахарозы ¦тов ¦тов ¦
¦ +-------T--------T------+первичном¦ +----T-----T-----T----T-----+------------+------+------+
¦ ¦сыворо-¦бессыво-¦среде ¦выделении¦ ¦глю-¦маль-¦саха-¦лак-¦фрук-¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦точном ¦роточном¦с 0,2%¦ ¦ ¦коза¦тоза ¦роза ¦тоза¦тоза ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦агаре ¦агаре ¦желчи ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦37 ¦37 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦град.C ¦град. C ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.gonorrhoeae ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ К ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.meningitidis¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ К ¦ К ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.subflava ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ К ¦ К ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.perflava ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ К ¦ К ¦ К ¦ - ¦ К ¦ + ¦ - ¦ + ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.flava ¦ + ¦ (+) ¦ + ¦ - ¦ + ¦ К ¦ К ¦ К ¦ - ¦ К ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦N.sicca ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.mucosa ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ К ¦ К ¦ К ¦ - ¦ К ¦ + ¦ + ¦ + ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.flavescens ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦
¦ ¦ ¦ (-) ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.lactamatica ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ + ¦ К ¦ К ¦ - ¦ К ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦
+--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+------+
¦N.(Br.) ¦ + ¦ + ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ - ¦ + ¦
¦catarrhalis ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L--------------+-------+--------+------+---------+--------+----+-----+-----+----+-----+------------+------+-------
Примечание. К - образование кислоты, (-) - редко.
Таблица 2
Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые
через 24 часа от начала бактериологического исследования
------------T-----------------T-------------T----------T-------T------------------------T--------------¬
¦Морфология ¦Интенсивность ¦Изменение ¦Обработка ¦Грам- ¦Наличие ¦Подозреваемые ¦
¦клеток ¦роста на агаре ¦цвета "шоко- ¦колонии ¦окраска+--------T--------T------+микроорганизмы¦
¦ +-------T---------+ладного" ¦3% KOH* ¦ ¦оксидазы¦каталазы¦уреазы¦ ¦
¦ ¦20% ¦"шоколад-¦агара ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦сыворо-¦ном" ¦вокруг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦точном ¦ ¦колонии ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Капсульные ¦ ++++ ¦ ++++ ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ + ¦ - ¦Neisseria ¦
¦полиморфные¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Meningitidis ¦
¦кокки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Мелкие ¦ - ¦ ++++ ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦Haemoрнilus ¦
¦полиморфные¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Influenzae ¦
¦палочки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Капсульные ¦ ++++ ¦ ++++ ¦желто-зеленый¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦Streptococcus ¦
¦удлиненные ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Pneumoninae ¦
¦парные ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦кокки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Цепочки и ¦ ++++ ¦ ++++ ¦ зеленый ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦Streptococci ¦
¦пары из ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦B,D, viridans ¦
¦кокков ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Мелкие ¦ ++++ ¦ ++++ ¦ зелено- ¦ - ¦ + ¦ - ¦ + ¦ - ¦Listeria ¦
¦палочки ¦ ¦ ¦ коричневый ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦monocytogenes ¦
¦"частоко- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦лом" и под ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦углом ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+--------------+
¦Пары и ¦ ++++ ¦ ++++ ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦ + ¦ + ¦Acinetobacter ¦
¦цепочки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Calcoaceticum ¦
¦коккобакте-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦рий ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-----------+-------+---------+-------------+----------+-------+--------+--------+------+---------------
Примечание.* - в каплю 3% раствора KOH вносят петлю (колонию)
культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы,
тянущейся за петлей, указывает на наличие грамотрицательный флоры
(-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).
Таблица 3
Дифференцирующие свойства стрептококков, вызывающих менингит
--------------T-------------T-----------T------------T-------------¬
¦ ¦S.pneumoniae ¦S.faecalis ¦S.agalactiae¦ "Зеленящие" ¦
¦ ¦ ¦ (гр. Д) ¦ (гр. В) ¦ ¦
+-------------+-------------+-----------+------------+-------------+
¦Гемолиз на ¦ а ¦ а, в, г ¦ в ¦ а ¦
¦5% кровяном ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦агаре ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+-----------+------------+-------------+
¦САМР - тест ¦ - ¦ - ¦ + ¦ - ¦
+-------------+-------------+-----------+------------+-------------+
¦Лизис на ¦ + ¦ - ¦ - ¦ - ¦
¦кровяном ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦агаре вокруг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦диска с 20% ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦желчью ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+-----------+------------+-------------+
¦Рост после ¦ - ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦прогрева при ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦60 град. С, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦30 мин ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------+-------------+-----------+------------+-------------+
¦Разложение ¦ + или - ¦ + ¦ - ¦ - ¦
¦маннита ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-------------+-------------+-----------+------------+--------------
____________________________
а - греческая буква "альфа
в - греческая буква "бета"
г - греческая буква "гамма"
Примечание. В группу "зеленящих" стрептококков относятся 9
видов малоизученных стрептококков.
Приложение 4
к приказу
Министерства
здравоохранения
Республики Беларусь
22.12.2004 № 286
ИНСТРУКЦИЯ
"Использование реакции непрямой гемагглютинации
для выявления антител при менингококковой инфекции"
Глава 1
ПОКАЗАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковым
эритроцитарными диагностикумами серогрупп A, B и C проводят в
следующих случаях:
а) как дополнительный метод диагностики менингококковой
инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток
крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е.
в динамике. Оптимальным вариантом является обследование всех лиц
(скрининг) с подозрением на генерализованные формы менингококковой
инфекции (ГФМИ), что позволит существенно увеличить процент
лабораторного подтверждения ГФМИ (у взрослых - до 80%, у детей - до
60% случаев);
б) для ретроспективного выявления локализованных форм
менингококковой инфекции в очагах заболевания;
в) при проведении иммуноэпидемиологических исследований среди
населения с целью определения серонегативных контингентов;
г) при оценке иммунологической эффективности
противоменингококковой вакцинации.
Глава 2
МЕТОДИКА ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
(РНГА) С ЭРИТРОЦИТАРНЫМИ МЕНИНГОКОККОВЫМИ ДИАГНОСТИКУМАМИ
Реакцию непрямой гемагглютинации можно поставить как макро-,
так и микрометодом, причем в последнем случае используют только
микротитраторы "Такачи".
Различия между этими методами заключаются лишь в объемах
используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При
макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл
соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума.
В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и
0,025 мл диагностикума.
Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя
2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется
дополнительная экспозиция в течение 1 - 2 часов при комнатной
температуре.
2.1. Необходимые реагенты и приборы:
- эритроцитарные менингококковые серогруппы A, B и C
диагностикумы;
- сыворотки диагностические менингококковые
группоспецифические A, B и C;
- нормальная кроличья сыворотка, сухая кроличья плазма или
бычий сывороточный альбумин;
- исследуемый материал (сыворотка крови человека);
- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки
или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");
- термостат для поддержания температуры 37 град. C;
- водяная баня для поддержания температуры 56 град. C;
- потенциометр для измерения pH-растворов;
- пипетки стеклянные мерные;
- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05;
- хлорид натрия (NaCl);
- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Na2HPO4 X 12H20);
- калий форсфорно-кислый однозамещенный (КН2РО4);
- дистиллированная вода.
2.2. Подготовка ингредиентов.
2.2.1. Приготовление исходного забуферного физиологического
раствора pH 7,2 (ЗФР).
В 0,5 л дистиллированной воды растворяют: хлорида натрия
(NaCl) - 8,65 г, натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HP04 x
12Н20) - 1,92 г, калий форсфорно-кислый однозамещенный (КН2РО4) -
0,44 г.
Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой. После
растворения солей проверяют pH раствора, который должен быть равен
7,2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и
стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.
ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в
котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.
2.2.2. Стабилизирующий буфер.
В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью
сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный
альбумин (БСА).
Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной)
реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами.
Инактивированную при +56 град. C в течение 30 минут НКС или плазму
добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор),
БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.
2.2.3. Взятие крови.
Для проведения серологических исследований кровь от больных
ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с
соблюдением обычных правил асептики; при массовых серологических
исследованиях кровь берут из пальца.
После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают
стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят
сыворотку крови в холодильнике при +4 град. C. В реакции исследуют
сыворотки крови без признаков пророста.
Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером
(ЗФР). Титрование сывороток крови проводят в стабилизирующем буфере.
Глава 3
УЧЕТ РЕАКЦИИ
Реакцию оценивают по общепринятой 4-плюсовой системе. За титр
противоменингококковых антител принимают максимальное разведение
сыворотки крови, в котором наблюдают четко выраженную агглютинацию
эритроцитов с интенсивностью не менее чем на 2+, при условии, что в
предыдущих лунках реакция шла на 4+ или 3+. Сыворотки крови с
разведениями с 1:5 и выше с четко выраженной агглютинацией
эритроцитов оценивают как положительные.
Глава 4
РЕКОМЕНДУЕМЫЕ СРОКИ, КРАТНОСТЬ ОБСЛЕДОВАНИЯ
И ТРАКТОВКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕЗУЛЬТАТОВ
При выборе оптимальных сроков и кратности обследования больных
ГФМИ и для правильной трактовки серологических результатов
необходимо принимать во внимание ряд факторов, влияющих на уровень
антител: возраст больного, преморбидный фон, клиническую форму,
тяжесть и период болезни, сопутствующие заболевания, серологические
особенности возбудителя. При менингококковой инфекции, так же как и
при других инфекционных заболеваниях, правильная оценка результатов
серологических исследований может быть дана только при их
сопоставлении с эпидемиологическими и клиническими данными.
Оптимальные сроки взятия крови у больных ГФМИ - первые дни
болезни (1 - 3 день), вторая, третья и последующие недели болезни.
Первую сыворотку крови необходимо брать сразу же при поступлении
больного в стационар, последующие - через 7 - 10 дней.
4.1. РНГА при генерализованных формах менингококковой
инфекции.
4.1.1. РНГА с диагностикумами A и C.
Антитела с группоспецифическими полисахаридами менингококков
серогрупп A и C при ГФМИ можно выявить уже в первые дни болезни.
Число серопозитивных лиц среди взрослых больных составляет в эти
сроки около 40%. Максимальный уровень антител отмечается на II - III
неделях болезни, с IV - V недели уровень антител постепенно
снижается.
За условно-диагностический титр антител к полисахаридам
менингококков серогрупп A и C у взрослых и детей старше 3 лет
принимают положительную реакцию в разведении сыворотки крови 1:40 -
1:80, т.к. у лиц, не инфицированных менингококками в момент
обследования, антитела в таких титрах встречаются сравнительно редко
(9 - 11%).
У детей в возрасте до 1 года продукция антител выражена слабо,
в связи с чем положительные реакции наблюдаются обычно в более
поздние сроки (со II недели болезни).
У детей моложе 3 лет за условно-диагностический титр антител к
полисахаридам A и C принимают положительную реакцию в разведении
1:20 и выше, т.к. при отсутствии менингококковой инфекции у детей
этого возраста антитела не обнаруживаются, или встречаются в
единичных случаях в титрах не выше 1:5 - 1:10.
Интенсивность антителообразования неодинакова при различных
клинических формах менингококковй инфекции. При менингококцемии и
сочетанных формах (менингококцемия + менингит) уровень антител
обычно выше, чем при других формах болезни.
При тяжелом течении ГФМИ и особенно при инфекционно-
токсическом шоке противоменингококковые антитела обнаруживаются в
низких титрах, в отдельных случаях не выявляются вообще. При очень
тяжелом течении болезни, особенно при наличии тяжелых осложнений
(отек и набухание мозга), антителообразование выражено слабо: в
остром периоде болезни обнаруживают около 10% серопозитивных проб с
низкими титрами (1:5 - 1:10). В дальнейшем, при улучшении состояния
больных титры антител и число серопозитивных проб может возрастать.
Обнаружение уже на I неделе болезни антител к полисахаридам
менингококков серогрупп A и C в титре 1:160 и выше подтверждает
менингококковую этиологию заболевания. В некоторых случаях такие
титры антител, обнаруженные на I неделе болезни, могут сохраняться и
в более поздние сроки заболевания. Хотя у данных больных не
наблюдается сероконверсии, высокие показатели РНГА могут служить
достаточным основанием для серологического подтверждения диагноза
ГФМИ.
Диагноз ГФМИ определяется как этиологически подтвержденный при
наличии динамики (четырехкратного и более) нарастания уровня
антител. При двукратном нарастании титра антител - диагноз
оценивается как подтвержденный лишь при выраженной клинической
картине.
Число этиологически подтвержденных случаев ГФМИ методом РНГА
может достигнуть: у взрослых - 80%, у детей - в среднем 70% (в
возрастной группе до 3 лет - 60%, в старших возрастных группах -
80%).
4.1.2. РНГА с диагностикумом серогруппы B.
При интерпретации серологических данных, полученных при работе
с эритроцитарным диагностикумом на основе полисахарида менингококков
серогруппы B, необходимо учитывать следующие моменты.
Полисахарид менингококков серогруппы B слабый иммуноген, его
химическая структура идентична полисахариду E.Coli K1. Носительство
менингококков этой серогруппы может достигать 50% и более от числа
серогруппируемых штаммов менингококков, выделенных от здоровых лиц,
что может отражаться на высоком фоновом уровне антител к
полисахариду В среди населения (в 50% случаев могут определяться
антитела в титре 1:80 и выше).
Генерализованные формы менингококковой инфекции, обусловленные
менингококками серогруппы B, наиболее часто, до 60%, диагностируются
у детей первых трех лет жизни, у которых антителообразование
выражено слабо. При ГФМИ у взрослых, в большинстве случаев, в первые
дни уровень антител к менингококкам серогруппы B составляет 1:20 -
1:40, с последующей сероконверсией на II - III неделях. В отдельных
случаях (14%) содержание антител на II - III неделях болезни может
достигать титров 1:640 - 1:1280 и выше.
Учитывая данные о широкой циркуляции менингококков серогруппы
B среди населения, определить условно-диагностический титр антител к
менингококкам этой серогруппы довольно сложно. Серологическим
подтверждением клинического диагноза ГФМИ, вызванной менингококками
серогруппы B, можно считать нарастание уровня антител с 1:160 и
выше; у детей с 1:40 и выше.
4.1.3. Групповая специфичность РНГА.
При постановке РНГА с набором эритроцитарных диагностикумов
может выявляться одновременное присутствие антител к нескольким
полисахаридам. В таких случаях серогруппу менингококков, вызвавших
заболевание у данного больного, определяют по динамике нарастания
уровня антител к одному из полисахаридов. При этом разница
показателей парных сывороток должна быть не меньше чем на два
разведения. При получении одинаковых титров антител к двум
полисахаридам в условно-диагностических титрах, диагностируется ГФМИ
без установления серогруппы возбудителя.
4.2. РHГА при локализованных формах менингококковой инфекции
(назофарингит и бактерионосительство).
При локализованных формах менингококковой инфекции
серологические исследования не следует рассматривать как метод
диагностики, поскольку вопрос о носительстве или менингококковом
назофарингите решается на основании бактериологического
обследования. Но в ряде случаев при проведении исследований в очагах
ГФМИ серологические данные могут служить дополнительным тестом,
ретроспективно подтверждающим клинико-эпидемиологический диагноз
менингококковой инфекции. При этом следует проводить обязательное
исследование парных образцов сывороток крови, полученных с 10 - 14-
дневным интервалом.
При назофарингитах антителообразование более выражено, чем при
бактерионосительстве. У больных назофарингитами менингококковой
этиологии в 90% случаев выявляются противоменингококковые антитела,
причем в 50% случаев с титрами от 1:40 и выше. Среди
бактерионосителей независимо от серогруппы выделенного возбудителя
специфические антитела определяются в 65% случаев, а с титрами от
1:40 и выше - у 30% носителей.
В сыворотках крови, полученных от носителей, также как и от
больных, могут выявляться антитела к нескольким полисахаридам
менингококков. Нарастание антител к гомологичной серогруппе чаще
отмечают при носительстве менингококков серогруппы A. В отдельных
случаях динамика антител (сероконверсия) не позволяет серологически
установить доминирующую серогруппу менингококков, тогда определяют
носительство без установления серогруппы.
4.3. РНГА при иммуноэпидемиологических исследованиях.
Целью иммуноэпидемиологических исследований является
определение числа лиц вероятно восприимчивых к менингококковой
инфекции и групп риска. Анализ проводят по числу серопозитивных и
серонегативных лиц с учетом существующей эпидемиологической
ситуации.
Например, в период эпидемического неблагополучия увеличивается
число серопозитивных лиц и соответственно уменьшается число
серонегативных к эпидемической серогруппе менингококков. В период
спорадической заболеваемости, наоборот, растет число серонегативных
лиц.
При проведении иммуноэпидемиологических исследований среди
населения объем репрезентативных выборок устанавливается
эпидемиологом в соответствии с численностью и возрастным составом
коллектива, района, населенного пункта.
Определяемый фоновый уровень противоменингококковых антител
связан с заболеваемостью менингококковой инфекцией на данной
территории и уровнем носительства. Наиболее высокий уровень антител
в разные эпидемические периоды определяют к менингококкам серогруппы
B, что возможно, отражает их серологическое родство с E.Coli Kl,
моракселой, непатогенными нейссериями. При этом число серопозитивных
проб с титрами антител 1:20 и выше может достигать 90%.
К менингококкам серогруппы С уровень антител наименьший, число
серопозитивных сывороток крови с титром антител 1:20 и выше
составляет 8%.
Уровень антител к менингококкам серогруппы A дает достаточно
четкую характеристику эпидемиологической ситуации и отражает широту
циркуляции возбудителя.
Анализ серологических результатов эпидемиологических
исследований проводят на основании расчета следующих показателей:
а) процента от серонегативных проб, полученных с каждым из
эритроцитарных диагностикумов (A, B и C), который может отражать
число вероятно восприимчивых лиц к менингококковой инфекции;
б) процента серопозитивных проб (все серопозитивные сыворотки
крови, начиная с разведения 1:5 и выше), из числа которых выделяют
пробы с титрами антител:
- в возрастной группе до 3 лет с 1:10 и выше к полисахаридам A
и C, с 1:20 и выше к полисахариду В;
- в старших возрастных группах детей и у взрослых с 1:20 и
выше к полисахаридам A и C, с 1:80 и выше к полисахариду B. Процент
сывороток крови с указанными выше уровнями антител отражает
доминирующие на данной территории серогруппы менингококков.
Формирование поствакцинального иммунитета носит
группоспецифический характер. В связи с этим в зависимости от
используемой для профилактики менингококковой вакцины,
серологические исследования для оценки эффективности вакцинации
проводят с применением РНГА с гомологичным эритроцитарным
диагностикумом.
При вакцинации взрослых специфические противоменингококковые
антитела к полисахариду A выявляют в высоких титрах (1:40 - 1:60 и
выше) не менее чем у 80% привитых уже на III - IV неделе после
вакцинации. На протяжении последующих 6 - 8 месяцев у привитых титры
антител несколько снижаются, но сохраняются на повышенном уровне не
более двух лет.
|
